11 декабря 2012

Новая модель вируса гриппа демонстрирует его слабые места

Ученые из Исследовательского института Скриппса (TSRI) значительно продвинулись в понимании того, как вирус гриппа реплицируется внутри инфицированных клеток. Исследователи использовали передовые технологии молекулярной биологии и электронной микроскопии, чтобы подробно «рассмотреть» один из белковых комплексов гриппа. Изображения, сформированные в ходе исследования, показывают белки вируса гриппа в процессе саморепликации, освещая слабые места вируса, что, несомненно, будет представлять интерес для разработчиков лекарственных препаратов.

Отчет об исследовании, опубликован который был в онлайн версии журнала Science Express, сфокусирован на рибонуклеопротеиде (РНП) гриппа. Рибонуклеопротеиды содержат генетический материал вируса, а также особый фермент, который необходим вирусу в процессе создания своих копий.

«Работа над структурными исследованиями в этой области застопорилась по причине технических препятствий, и потому это достижение является весьма долгожданным», — говорит Ян Уилсон, профессор кафедры структурой биологии в TSRI и ведущий автор отчета, над которым также работали профессоры кафедры клеточной биологии TSRI Бриджит Каррагер и Клинт Поттер. «Данные, полученные в ходе этого исследования, дают нам намного более ясную картину механизма репликации вируса гриппа».

Раскрытие тайны рибонуклеопротеидов

В основе любого вируса гриппа лежит восемь рибонуклеопротеидов, крошечных молекулярных механизмов, которые жизненно важны для способности вируса к выживанию и распространению внутри своего «хозяина». Каждый РНП содержит сегмент – как правило, один протеин-кодирющий ген – РНК-вирусного генома. Такой сегмент вирусной РНК покрыт защитным вирусным нуклеопротеидом и имеет структуру, которая напоминает скрученную петлю цепочки. Свободные концы этой перекрученной петли удерживаются ферментом-полимеразой вируса гриппа, который решает две центральные задачи вирусной репродукции: создание новой вирусной геномной РНК, и создание транскриптов РНК, которые превратятся в вирусные белки.

Помимо того, что полимераза гриппа важна для обычных инфекций, она содержит в себе некоторые ключевые «видовые барьеры», которые не позволяют, например, вирусам птичьего гриппа заражать млекопитающих. В прошлом мутации в ключевых точках фермента позволили вирусу инфицировать новые виды. Итак, исследователи стремились узнать определенные подробности процесса взаимодействия полимеразы гриппа и остальных РНП.

Получение этих подробностей было действительно сложной задачей. Одной из причин является тот факт, что рибонуклеопротеиды гриппа являются сложными сборками, которые крайне затруднительно эффективно синтезировать в лаборатории. Гены полимеразы гриппа особо устойчивы к экспрессированию в тестовых клетках, а продуцируемые ими белки существуют в виде трех раздельных фрагментов, или субэлементов, которые должны каким-то образом самособираться. До настоящего момента единственные рибонуклеопротеиды гриппа, которые были созданы в лаборатории, представляли собой укороченные версии РНП, структуры которых не совсем соответствует структурам естественных РНП гриппа. Исследователи также ограничены в количестве вирусного материала, который они могут использовать для подобных исследований.

Тем не менее, исследовательской группе удалось разработать систему экспрессирования в тестовых клетках, которая позволила продуцировать все компоненты белка и РНК необходимые для образования полноценных РНП гриппа. «Мы смогли получить клетки, позволившие надлежащим образом собрать эти компоненты, следовательно, мы имели действующие самореплицирующиеся РНП», — говорит Роберт Н. Кирхдоерфер, первый автор исследования. Кирхдоерфер являлся соискателем степени кандидата наук, работая в лаборатории Уилсона во время исследования, на данный момент он – научный сотрудник с кандидатской степенью в лаборатории профессора TSRI Эрики Олман Сафир.

Со временем Кирхдоерфер очистил РНП гриппа в количестве достаточном для проведения анализа электронным микроскопом группой TSRI по работе с автоматизированными системами молекулярной визуализации, руководство которой осуществляется совместно Каррегер и Поттером.

Невиданное ранее

Новшества группы по визуализации позволили исследователям проанализировать молекулярные образцы с меньшим трудом, за меньшее время, и с использованием меньшего количества исходного материала. «Мы смогли, например, автоматически собирать данные в течение нескольких дней подряд, что является необычным при работе с электронными микроскопами», — говорит Арне Моэллер, научный сотрудник с кандидатской степенью группы по визуализации, который также являлся первым автором исследования.

Электронные микроскопы создают высокоразрешающие изображения своих крошечных мишеней при помощи электронов, а не фотонов света. Изображения выявили многочисленные, четко показанные РНП-комплексы. К удивлению Моэллера и его коллег, во многих из них у РНП имелись отростки, о которых не было известно ранее. «Они ветвились – это было очень захватывающим зрелищем», — говорит он.

«По существу, это были снимки реплицирующихся РНП гриппа, т.е. то, чего раньше мы никогда не видели», — говорит Кирхдоерфер. Эти и другие данные, полученные благодаря изображениям десятков тысяч отдельных РНП, позволили исследовательской группе сформировать наиболее полную пока модель структуры и функций РНП гриппа. Модель подробно показывает, как полимераза связывается со своим РНП, как она выполняет сложную задачу по транскрипции вирусных генов, и как отдельные копи вирусной полимеразы способствуют доведению до конца процесса репликации РНП. «Теперь нам удалось взять многое из того, что нам уже было известно о вирусном РНП ранее и отобразить все это на определенных частях структуры РНП», — говорит Кирхдоерфер.

Новая модель вируса гриппа освещает некоторые слабые места вируса. Одно из них – это изменение формы, которое субэлемент полимеразы (захватывающий вирусную РНК и подтягивающий ее к активному центру второго субэлемента) должен пройти во время транскрипции вирусного гена. Второе – это ключевое взаимодействие между полимеразой и вирусными нуклеопротеидами. РНП гриппа длинные и гибкие, они изгибаются на изображениях, полученных при помощи микроскопа; соответственно, структурная модель остается только в незначительной степени мелкозернистой. «Конечно, нельзя разработать лекарства, основываясь только на этой модели», — говорит Кирхдоерфер. «Однако теперь мы гораздо лучшее представляем себе, как действует РНП гриппа, а это все-таки наводит на мысль о некоторых возможностях для создания более эффективных препаратов от гриппа».

Источник: medicalnewstoday.com

Далее по теме: