В это время в России была введена приват-доцентура, позволяющая желающим проявить свои научные познания и преподавательские способности и впоследствии иметь возможность занять штатное место профессора. Воспользовавшись этим обстоятельством и освободившись наконец от запрета преподавать, П. Ф. Лесгафт обратился к попечителю Петербургского учебного округа с просьбой разрешить ему читать лекции по анатомии в качестве приват-доцента.
Прошение было удовлетворено, и 24 сентября 1886 года Петр Францевич занял место за университетской кафедрой. Начался новый этап его преподавательской деятельности — десять лет работы в прославленном столичном университете на физико-математическом факультете, в состав которого входила и кафедра зоологии, анатомии и физиологии. По достоинству оценив значение открытия В. Рентгена, он одним из первых стал использовать новый метод — рентгенологическое исследование для изучения внутренних органов и суставов.
П. Ф. Лесгафт был одним из основоположников лечебной гимнастики в нашей стране. Многие приемы, применявшиеся им для коррекции врожденных и приобретенных дефектов развития костно-мышечной системы у детей, успешно используются и в настоящее время. Вместе с Ф. Ф. Эрисманом и А. П. Доброславиным он разработал основы школьной гигиены и участвовал в практическом внедрении их в некоторые учебные заведения Петербурга. Он принимал участие в создании кабинета гигиены, ставшего первым в России гигиеническим музеем.
Написанная П. Ф. Лесгафтом в 1870 году «Инструкция для измерения живого человека» была первым отечественным руководством по врачебному контролю, практическое обучение которому он проводил на открытых им учебно-гимнастических курсах. Созданная им Биологическая лаборатория явилась одним из первых в России научно-исследовательских институтов, в котором в советское время работали такие крупные ученые-академики, как Л. А. Орбели, А. А. Борисяк, В. Н. Любименко, В. А. Омелянский и др.
Труды Петра Францевича сыграли важную роль в развитии научных основ прогрессивной педагогики. «Руководство по физическому образованию детей школьного возраста» было первой фундаментальной работой, в которой физическое воспитание и образование строятся на научных основах с учетом анатомо-физиологических и психологических особенностей учащихся.
Велики заслуги профессора Лесгафта в деле женского медицинского образования, страстным защитником которого он был всю жизнь. Неоценима роль Петра Францевича в Деле развития физической культуры в нашей стране. После революции 1917 года на базе созданных и руководимых им курсов воспитательниц и руководительниц физического образования был открыт Государственный институт физического образования, ныне Государственный институт физической культуры им. П. Ф. Лесгафта. В 1959 году на территории института был сооружен памятник П. Ф. Лесгафту.
Осенью 1909 года Петр Францевич Лесгафт простудился и тяжело заболел. Болезнь дала осложнения на почки, и врачи настойчиво рекомендовали ему сухой жаркий климат и санаторное лечение. В Гелуани находился санаторий, которым руководили русские врачи. Туда и решили отвезти П. Ф. Лесгафта. К сожалению, болезнь зашла слишком далеко. 28 ноября 1909 года Петра Францевича не стало. Хоронили его в Петербурге при огромном стечении народа.
М.С. Шойфет, «Сто великих врачей»