Принцип метода
Уробилиноген с пара-диметиламинобензальдегидом образует комплекс, окрашенный в красный цвет; интенсивность окраски пропорциональна содержанию уробилиногена. Для восстановления уробилина в уробилиноген используют аскорбиновую кислоту и гидрат окиси железа. Для увеличения специфичности реакции добавляют ацетат натрия.
Необходимые реактивы
I. 4-диметиламинобензальдегид (пара-диметиламинобензальдегид).
II. НСl концентрированная; реактив Эрлиха: 0,7 г пара-диметиламинобензальдегида растворяют в 150 мл концентрированной НСl, приливают к 100 мл дистиллированной воды и смешивают. Раствор должен быть бесцветным или слегка желтоватым. Хранят в посуде из темного стекла. Реактив стабилен.
III. Натрия ацетат, насыщенный раствор: 375 г CH3COONa * 3H2O (или 226 г CH3COONa) растворяют в 250 мл теплой дистиллированной воды, охлаждают до комнатной температуры. Хранят при температуре 20 °С. Раствор должен быть бесцветным и прозрачным.
IV. Аскорбиновая кислота.
V. Натр едкий: 0,5 г/л раствора.
VI. Бария хлорид, 100 г/л раствора.
VII. Фенолсульфофталеин (феноловый красный). Используют для приготовления калибровочного раствора.
VIII. Основной калибровочный раствор: 20 мг фенолсульфофталеина растворяют в 100 мл 0,5 г/л раствора едкого натра. Стабилен при хранении. Рабочий калибровочный раствор готовят разведением основного раствора 0,5 г/л раствором едкого натра в 100 раз. Стабилен в течение недели с условием хранения при 20 °С. Рабочий раствор содержит 0,2 мг фенолсульфофталеина в 100 мл и эквивалентен по окраске раствору уробилиногена — 0,345 мг на 100 мл.
Точность приготовления можно проверить измерением оптической плотности раствора на спектрофотометре: при длине волны 562 нм оптическая плотность раствора должна быть 0,380—0,390.
Специальное оборудование — фотоэлектроколориметр или спектрофотометр.
Исследование проводят в первые 2—3 ч после мочеиспускания. При наличии мутности мочу центрифугируют, а затем проводят качественное определение билирубина. Если обнаруживают билирубин, то 8 мл мочи смешивают с 2 мл 100 г/л раствора хлорида бария и фильтруют через бумажный фильтр. Конечный результат умножают на 1,25, чтобы внести поправку на разведение.
Ход исследования
100 мг аскорбиновой кислоты растворяют в 10 мл исследуемой мочи и помещают по 1,5 мл в 2 пробирки для опытной и холостой пробы. В пробирку с холостой пробой прибавляют 4,5 мл свежеприготовленной смеси одного объема раствора Эрлиха и двух объемов насыщенного раствора ацетата натрия. В пробирку с опытной пробой прибавляют 1,5 мл раствора Эрлиха и немедленно приливают 3 мл насыщенного раствора ацетата натрия. Через 5 мин измеряют экстинкцию обеих проб против воды на фотоэлектроколориметре при длине волны 500—590 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя в 1 см, на спектрофотометре при длине волны 562 нм. Рабочий калибровочный раствор измеряют при тех же условиях, что и опытную пробу.
Результаты выражают в единицах Эрлиха (1 ед. соответствует 1 мг уробилиногена). Концентрацию уробилиногена выражают количеством единиц Эрлиха в 100 мл мочи (Едэ).
Расчет производят по формуле: Едэ = Е0 – Еx/Ек * 0,346 * 6,0 / 1,5 = Е0 – Еx/Ек * 1,38,
где Ео — экстинкция опытной пробы;
Ех — экстинкция холостой пробы;
Ек — экстинкция калибровочной пробы;
0,346 — концентрация уробилиногена в растворе (0,346 мг на 100 мл), окраска которого эквивалентна окраске калибровочного раствора фенолфталеина;
6,0 — объем пробы, мл;
1,5 — количество мочи в пробе, мл. Соотношение ингредиентов при определении уробилиногена в моче представлено в табл.
Соотношение ингредиентов (в мл) при определении уробилиногена в моче
|
№
|
Компоненты
|
Проба
|
||
|
опытная
|
холостая
|
калибровочная
|
||
| 1 | 10 мл мочи + 100 мг аскорбиновой кислоты | 1,5 | 1,5 | — |
| 2 | Реактив Эрлиха | — | 1,5 | — |
| 3 | Насыщенный раствор ацетата натрия | — | 3,0 | — |
| 4 | Смесь компонентов 2 и3 в соотношении 1 : 2 | 4,5 | — | — |
| 5 | Рабочий калибровочный раствор | — | — | 6,0 |
Рекомендуется собирать мочу в посуду из темного стекла, так как при дневном свете окисление уробилиногена происходит значительно быстрее.
Для расчета выделения уробилиногена за определенное время для исследования надо брать мочу из всего собранного за это время объема и, учитывая его.
Провести расчеты по формуле: Е0 – Еx/Ек * 1,38 * V/100,
где V — объем мочи, мл, выделенный за определенный промежуток времени;
1/100 — коэффициент для расчета количества уробилиногена в 1 мл мочи.