К 2 мл исследуемой сыворотки прибавляют 2,5 мл воды и 1,5 мл 20%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают и ставят на 15 мин на водяную баню температуры 90—95 °С. Затем центрифугируют в течение 20 мин при скорости 2000 об./мин и отбирают 4 мл прозрачного слоя, к которым приливают 0,35 мл 70%-ного раствора аммония ацетата и 0,3 мл раствора сульфата гидразина. Смесь фотометрируют при длине волны 535 нм в кюветах с длиной оптического пути 1 см, затем прибавляют 0,4 мл раствора сульфонированного батофенантролина, оставляют на 1 ч и снова фотометрируют при той же длине волны. Обе фотометрии выполняют против холостого опыта, в котором берут вместо исследуемой сыворотки 2 мл воды.
Калибровку проводят так же, как и основной опыт, но вместо сыворотки берут 2 мл калибровочного раствора.
Расчет сывороточного железа (мкмоль/л) выполняют по формуле:
Еоп1 – Еоп2/Ек1 – Ек2 *30,
где Еоп1 и Еоп2 — отсчеты опытной пробы до и после прибавления раствора сульфонированного батофенантролина;
Ек1 и Ек2 — соответственно результаты фотометрии калибровочной пробы;
30 — содержание железа в калибровочном растворе, мкмоль/л.
Надо тщательно следить за содержанием железа в дистиллированной воде и реактивах, используя в случае необходимости бидистиллированную воду, приготовленную в стеклянном перегонном аппарате. Если после удаления белков не удается набрать точно 4 мл надосадочной жидкости, можно взять меньшее ее количество и сделать поправку при расчете или же взять точно такое же количество калибровочного раствора.