С помощью этого метода производят количественное определение холестерина в желчи. Холестерин в присутствии уксусного ангидрида и смеси уксусной и серной кислот дает зеленое окрашивание.
Для этого используют:
-
смесь из 1 части ледяной уксусной кислоты, 5 частей уксусного ангидрида и 1 части концентрированной серной кислоты; смесь должна быть бесцветной или желтоватой; хранят в посуде из темного стекла с притертой пробкой в холодильнике;
-
стандартный раствор холестерина — 1800 мг/л (180 мг холестерина растворяют в 2,5 мл хлороформа в мерной колбе вместимостью 100 мл и доводят до метки абсолютным спиртом); раствор хранят в посуде из темного стекла с притертой пробкой, которую парафинируют; 1 мл раствора содержит 1,8 мг холестерина.
К 2,1 мл смеси реактивов добавляют 0,1 мл исследуемого материала (желчи). Пробирку энергично встряхивают 10—12 раз и ставят в термостат на 10 мин при температуре 37 °С. Измерения производят на ФЭКе против реактива 1 при красном светофильтре (630—690 нм) в кювете с толщиной слоя в 5 мм.
Расчет ведут по калибровочному графику.
Для калибровочного графика готовят из основного стандартного раствора холестерина ряд разведений.
Ряд разведений из основного стандартного раствора холестерина
|
№ пробирки
|
Количество стандартного холестерина мл
|
Количество реактива мл
|
Количество холестерина в пробе мг
|
Концентрация холестерина
|
|
|
мг/л
|
г/л
|
||||
| 1 | 0,05 | 2,15 | 0,09 | 900 | 0,9 |
| 2 | 0,10 | 2,10 | 0,18 | 1800 | 1,8 |
| 3 | 0,15 | 2,05 | 0,27 | 2700 | 2,7 |
| 4 | 0,20 | 2,00 | 0,36 | 3600 | 3,6 |
| 5 | 0,25 | 1,95 | 0,45 | 4500 | 4,5 |
Рабочие стандартные растворы обрабатывают так же, как опытные пробы.
Известен ряд колориметрических методов на желчные кислоты, в которых используются реакция Петтенкофера и ее модификации, основанные на взаимодействии желчных кислот с сахаром в присутствии серной кислоты. В результате реакции образуется фурфурол и раствор окрашивается в вишнево-красный цвет. Эта реакция специфична для холевой и парных (гликохолевой и таурохолевой) кислот, остальные желчные кислоты не вступают в данную реакцию.
В норме согласно И.А. Скуя:
- в порции А концентрация холестерина составляет 1,3—2,8 ммоль/л (50—110 мг%), холатов — 17,4—52,0 ммоль/л (670—2000 мг%);
- в порции В концентрация холестерина — 5,2—15,6 ммоль/л (200—600 мг%), холатов — 57,2—184,6 ммоль/л (2200—7100 мг%);
- в порции С содержание холестерина 1,1—3,1 ммоль/л (45—120 мг%), холатов — 13,0—57,2 ммоль/л (500—2200 мг%).
Приведенные нормативы показывают большие физиологические колебания состава желчи. Н.А. Скуя предлагает считать гиперхолестеринохолией концентрацию холестерина выше 6,5 ммоль/л (250 мг%) в одной или нескольких печеночных (порции А и С) фракциях, а гипохолестеринохолией — концентрацию холестерина менее 2—2,6 ммоль/л (80—100 мг%) во всех печеночных фракциях.
Особое практическое значение имеет холато-холестериновый коэффициент (х/х). У здоровых лиц он обычно выше 10. Снижение х/х коэффициента (менее 10) является индикатором склонности к камнеобразованию в желчевыводящей системе При оценке х/х коэффициента необходимо сопоставлять с данными микроскопического анализа (обнаружения скоплений кристаллов холестерина, аморфных масс билирубината кальция, микролитов).