Метод исследования активности щелочной фосфатазы (необходимые реактивы)

Необходимые реактивы

I. п-нитрофениловый эфир фосфорной кислоты, динатриевая соль.

II. НСl, 0,001 моль/л.

III. п-Нитрофенилфосфат натрия, 4 г/л раствор в 0,001 моль/л раствора НСl: 0,4 г п-нитрофенилфосфата помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доливают до метки 0,001 моль/л раствором НСl. В связи с тем, что в продаже чаще имеется бариевая соль п-нитрофенилфосфата, то перевод ее в натриевую соль осуществляется следующим способом: к навеске п-нитрофенилфосфата бария, соответствующей получению 9 г/л раствора и помещенной в фарфоровую ступку, добавляют небольшими количествами 0,001 моль/л раствор НСl в процессе растирания соли в ступке в течение 10 мин.

Добавлением насыщенного раствора сульфата натрия (1 мл на 100 мл раствора) бариевую соль переводят в натриевую. Через 5 мин полученный раствор п-нитрофенилфосфата натрия фильтруют в делительную воронку, где затем взбалтывают с равным объемом водонасыщенного бутилового спирта. После разделения слоев жидкости в делительной воронке (вверху — бутанол, внизу — постепенно обесцвечивающийся субстратный раствор) бутанол выливают, а субстратный раствор подвергают описанной выше процедуре очистки еще 2—3 раза, пока он не станет совершенно бесцветным. После бутанола производят экстракцию водонасыщенным эфиром 1—2 раза.

Реактив не должен содержать свободного п-нитрофенола, отсутствие которого в субстратном растворе проверяется следующей пробой: к 1 мл субстратного раствора прибавляют 10 мл 0,02 моль/л раствора едкого натра и измеряют на ФЭКе при длине волны 400—420 нм (фиолетовый светофильтр). Экстинкция должна быть меньше 0,08, если экстинкция больше 0,08, необходимо удалить свободный п-нитрофенол.

Для этого реактив экстрагируют 2 или 3 раза равными объемами бутилового спирта и один раз — эфиром. Затем удаляют следы эфира выдерживанием на воздухе. Бутиловый спирт и эфир должны иметь нейтральную реакцию. Если реактив не выдерживает указанный выше тест, то экстрагирование повторяют. Хранят раствор в холодильнике в замороженном состоянии в течение 2—3 недель.

IV. Аминоуксусная кислота (гликокол, глицин).

V. Магния хлорида 6-водный.

VI. Натр едкий, растворы 0,1 моль/л, 0,02 моль/л, не содержащие углекислого газа.

VII. Буферный раствор — 0,05 моль/л глициновый буфер с добавлением катализатора хлорида магния — 95 мг/л: 375 мг глицина и 10 мг MgCl₂ • 6Н₂О растворяют в 42 мл 0,1 моль/л раствора едкого натра и доводят объем водой до 100 мл.

VIII. Субстратно-буферный раствор готовят смешиванием равных частей растворов 3 и 7, рН раствора 10,5. При смешивании 2 мл раствора с 10 мл 0,02 моль/л раствора едкого натра реактив не должен давать экстинкцию на ФЭКе более 0,1 (толщина слоя — 1 см, длина волны — 400—420 нм). В противном случае раствор негоден или подлежит реэкстрагированию бутанолом или эфиром. После экстракции необходимо снова установить рН. Хранят в холодильнике в течение 2—3 дней.

IX. п-нитрофенол — калибровочный раствор 5 * 10–5 моль/л: 696 мг п-нитрофенола растворяют в 0,02 моль/л растворе едкого натра и доводят этим же раствором объем до 1 л, 1 мл раствора содержит 5 мкмолей п-нитрофенола.

Далее по теме: