Ход определения
Опытная проба: 0,1 мл сыворотки, разведенной 1:2, смешивают с 0,3 мл раствора НАД, прогревают 5 мин при температуре 37 °С. Затем добавляют 0,8 мл 0,03 моль/л раствора пирофосфата натрия и 0,2 мл 0,45 моль/л раствора лактата натрия, предварительно прогретых при температуре 37 °С, и инкубируют смесь при температуре 37 °С в течение 15 мин. Тотчас после инкубации добавляют 0,5 мл раствора 2,4-динитрофенилгидразина, выдерживают 20 мин при комнатной температуре. Затем добавляют 5 мл 0,4 моль/л раствора едкого натра, перемешивают и через 10 мин измеряют на ФЭКе в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 500—560 нм (зеленый светофильтр) против холостой пробы. Холостую пробу ставят, как опытную, но сыворотку добавляют после инкубации.
Расчет активности производят по калибровочному графику.
Построение калибровочного графика: из рабочего калибровочного раствора пирувата натрия готовят ряд разведений, как указано в табл.
Исследование активности лактатдегидрогеназы
| № пробирки | Рабочий калибровочный раствор пирувата натрия (мл) | 0,03 моль/л раствор пирофосфата натрия (мл) |
Бидистиллированная вода (мл) |
Содержание пировиноградной кислоты в калибровочной пробе | Активность ЛДГ нмоль/(с∙л) | |
| мкг | мкмоль | |||||
| 1 | 0,1 | 0,8 | 0,5 | 0,88 | 0,01 | 334 |
| 2 | 0,2 | 0,8 | 0,4 | 1,76 | 0,02 | 668 |
| 3 | 0,4 | 0,8 | 0,2 | 3,52 | 0,04 | 1336 |
| 4 | 0,6 | 0,8 | — | 5,28 | 0,06 | 2004 |
| 5 | 0,8 | 0,6 | — | 7,04 | 0,08 | 2672 |
Затем в пробирки приливают по 0,5 мл раствора 2,4-динитрофенилгидразина. Далее калибровочные пробы обрабатывают и измеряют, как опытные. Холостую пробу ставят так же, как калибровочную, но вместо калибровочного раствора добавляют воду.
Линейная зависимость между концентрацией пировиноградной кислоты и оптической плотностью сохраняется от 0 до 3000 нмоль/(с∙л).