Метод исследования активности креатинкиназы (необходимые реактивы)

Необходимые реактивы

I. Аденозин-5-трифосфорной кислоты динатриевая соль.

II. L-цистеин, 0,024 моль/л: 2,9 мг растворяют в 1 мл воды. Готовят раствор перед употреблением. На одну пробу требуется 0,1 мл.

III. Креатин.

IV. Магния сульфат 7-водный.

V. Аммоний молибденовокислый 4-водный, 0,02 моль/л: 2,5 г молибденовокислого аммония растворяют в мерной колбе в 70—80 мл воды и доводят объем до 100 мл водой.

VI. Натрия сульфат безводный.

VII. Натрий сернистокислый пиро (метабисульфит натрия).

VIII. 1-амино-2-нафтол-4-сульфокислота (эйконоген).

IX. Серная кислота, 2,5 моль/л.

X. НСl, 0,1 моль/л.

XI. Трис-(оксиметил)-аминометан (трис).

XII. Трис-буфер, 0,133 моль/л, рН 9,0: 1,61 г трис растворяют в мерной колбе вместимостью 100 мл в 50—60 мл воды, устанавливают рН буфера 0,1 моль/л раствором НСl и доводят водой до метки.

XIII. Раствор эйконогена: 15,36 г пиросернистокислого натрия, 0,512 г сернистокислого натрия и 0,128 г эйконогена растворяют в 70—80 мл воды, взбалтывают, доводят объем водой в мерной колбе до 100 мл и дважды фильтруют (через 2 ч и через сутки после приготовления). Раствор следует беречь от яркого света; в случае выпадения осадка вновь фильтруют. Стабилен в течение 1 месяца при хранении в холодильнике.

XIV. Основная смесь реактивов, содержащая 0,02 моль/л сульфата магния, 0,033 моль/л креатина и 0,0067 моль/л АТФ: 0,4920 г сульфата магния, 0,4326 г креатина и 0,3692 г АТФ растворяют в 70—80 мл трис-буфера (для полного растворения креатина смесь нагревают в течение 5—10 мин на водяной бане при температуре 40—45 °С). Затем объем основной смеси реактивов доводят трис-буфером в мерной колбе до 100 мл.

XV. Трихлоруксусная кислота, 4,9 моль/л: 80 г ТХУ растворяют в 50—60 мл воды и объем раствора доводят в мерной колбе до 100 мл.

XVI. Смесь растворов для проведения кислотного гидролиза креатинфосфата. Смесь готовят перед употреблением, учитывая, что на одну пробу расходуют 2 мл. Смесь состоит из 0,25 мл раствора молибденовокислого аммония, 0,25 мл раствора серной кислоты и 1,5 мл воды (соотношение 1 : 1 : 6).

XVII. Калия фосфат однозамещенный безводный (для приготовления калибровочного раствора): 0,0169 г КН2РО4 растворяют в воде и объем раствора доводят в мерной колбе до 100 мл.

Специальное оборудование: фотоэлектроколориметр.

Далее по теме: