Метод определения активности АСТ (ход определения)

Ход определения

Перед определением температура растворов и сыворотки должна быть доведена до температуры измерения. Перед работой можно готовить смесь реактивов, состоящую из субстратно-буферного раствора, раствора НАДН, МДГ и ЛДГ в соотношении 60 : 1 : 1 : 1. Определение проводят по следующей схеме.

Перемешивают и через 60 сек. (лаг-фаза) измеряют экстинкцию и одновременно включают секундомер. Точно через 1, 2, 3 мин (или через более короткие, но равные промежутки времени) измеряют экстинкцию.

Поправку на холостой опыт проводят по формуле:

(ΔΕ/Δt)_оп – (ΔΕ/Δt)_хол = (ΔΕ/Δt)_скор.

Скорректированную величину опытной пробы используют в дальнейших расчетах.

Расчет производят по формуле:

Активность, моль/(с∙м³) = нмоль/(с∙л) * 10⁶ = V_р.с / ε * 1∙V_сыв * (ΔΕ / Δt)_скор,

где V_р.с — объем реакционной смеси, мл;

V_сыв — объем сыворотки, мл;

t — время реакции, сек.;

ΔΕ / Δt — изменение экстинкции за 1 сек.;

ε — κоэффициент молярной экстинкции НАДН в м² * моль–1;

1 — толщина слоя жидкости в кювете в метрах (1∙10²).

Примечание

Определение активности фермента можно проводить по микрометоду. Для этого перед работой готовят смесь реактивов, состоящую из субстратно-буферного раствора, растворов НАДН, ЛДГ, МДГ в соотношении 60 : 1 : 1 : 1. Опытная проба включает смесь реактивов — 0,630 мл, сыворотку — 0,10 мл, α-кетоглутаровую кислоту — 0,02 мл. Холостую пробу ставят так же, как опытную, но вместо сыворотки добавляют 154 ммоль/л раствор хлорида натрия. Определение проводят по той же схеме, что и в макрометоде.

Далее по теме: