Метод определения активности АСТ

Необходимые реактивы

I. Калия фосфат однозамещенный (КН₂РО₄).

II. Калия фосфат двузамещенный (К₂НРО₄ * 3Н₂О).

III. L-аспарагиновая кислота или L-аспарагиновой кислоты натриевая соль.

IV. Фосфатный буфер 0,1 моль/л, рН 7,4: 0,16 г однозамещенного фосфата калия и 2,07 г двузамещенного фосфата калия трехводного растворяют в 40—160 мл воды, проверяют рН и доводят водой в мерной колбе до 100 мл. Стабилен при хранении в холодильнике.

V. Субстратно-буферный раствор 0,25 моль/л L-аспарагиновой кислоты в 0,1 моль/л фосфатном буфере рН 7,4: 3,30 г L-аспарагиновой кислоты (или 3,9 г натриевой соли L-аспарагиновой кислоты) растворяют в 40—50 мл 0,1 моль/л фосфатного буфера, проверяют рН и доводят фосфатным буфером в мерной колбе до 100 мл. Если применяют L-acпaрагиновую кислоту, то к навеске перед растворением в фосфатном буфере для установления рН 7,4 добавляют примерно 20—26 мл 1 моль/л раствора едкого натра и затем проверяют рН. Стабилен при хранении в холодильнике в течение месяца.

VI. β-никотинамидадениндинуклеотид восстановленный, динатриевая соль, 15 ммоль/л: 16 мг НАДH * Na₂ * 4H₂O растворяют в 1,5 мл воды. Раствор стабилен в течение 2 недель при хранении в темной посуде в холодильнике. Коэффициент молярного поглощения не ниже 5,6 * 10² м² ∙ моль–1 при 340 нм.

VII. α-κетоглутаровая кислота, 0,45 моль/л: 0,2 г α-кетоглутаровой кислоты растворяют в 2,5 мл воды и добавляют 5 моль/л раствора едкого натра. Если используют динатриевую соль α-кетоглутаровой кислоты, то 0,26 г соли растворяют в 3 мл воды, раствор стабилен в течение 2 недель при хранении в холодильнике. α-кетоглутаровая кислота не должна содержать примесей пирувата и малата.

VIII. Малатдегидрогеназа из сердца свиньи (L-малат: NAD⁺ оксидоредуктаза). Суспензия в 50%-ном растворе глицерина. Специфическая каталитическая активность выше 17 ммоль/(с∙л).

Примеси: АсАТ < 0,01%, ГлДГ < 0,003%, ЛДГ < 0,01%. Для приготовления рабочего раствора к 20 мкл суспензии добавляют 5 мл воды.

IX. Лактатдегидрогеназа из скелетной мышцы кролика или свиньи. Суспензия в 50%-ном растворе глицерина. Специфическая каталитическая активность выше 8 ммоль/(с∙л).

Примеси: АсАТ < 0,01%, ГлДГ < 0,003%, АлАТ < 0,01%. Для приготовления рабочего раствора к 40 мкл суспензии добавляют 5 мл воды. Стабилен в течение 3 месяцев при хранении в холодильнике в хорошо укупоренной посуде.

X. Натр едкий, 5 моль/л, 1 моль/л.

XI. Натрия хлорид, 154 ммоль/л (физиологический раствор).

Примечание

Для определения активности АсАТ и АлАТ по оптическому тесту используют отечественные реактивы или импортные, например, можно использовать реактивы фирмы «Reanal» Все реактивы готовят на бидистиллированной воде, хранят при температуре от 0 до +4 °С. Уменьшение стабильности может наступить за счет роста микроорганизмов. Поэтому в растворы рекомендуется добавлять несколько капель хлороформа.

Специальное оборудование

Спектрофотометр с термостатированной кюветой. Измерение проводят при 340 нм.

Далее по теме: