Определение глюкозы в крови, плазме (сыворотке) и спинно-мозговой жидкости глюкозооксидазным методом

Принцип метода

Глюкоза в присутствии фермента глюкозооксидазы окисляется кислородом воздуха с образованием в ходе реакции перекиси водорода. Перекись водорода в присутствии фермента пероксидазы окисляет ортотолидин с образованием окрашенного соединения, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию глюкозы.

Нормальное содержание глюкозы — 4,1—5,9 ммоль/л, в возрасте от 60 до 90 лет — 4,6—6,4 ммоль/л, у детей — 3,3—5,6 ммоль/л.

Необходимые реактивы

I. Натрия хлорида 9 г/л (изотонический раствор): готовят, растворяя 0,9 г NaCl в 100 мл воды.

II. Цинка сульфат, 50 г/л: 5 г сульфата цинка (ZnSО₄) растворяют в воде, объем доводят до 100 мл.

III. Натр едкий, 0,3 моль/л: готовят, растворяя 1,2 г NaOH в 100 мл воды, концентрацию проверяют титрованием (она должна быть 0,3 н).

IV. Ортотолуидин, 1%-ный раствор: 1 г препарата растворяют в 100 мл абсолютного спирта. Раствор можно хранить в холодильнике в склянке с притертой пробкой несколько месяцев. Имеющийся в продаже препарат можно очистить перекристаллизацией, для чего его растворяют в абсолютном спирте, добавляют воду и выпавшие кристаллы отсасывают на фильтре, затем сушат над хлоридом кальция.

V. Ацетатный буферный раствор рН 4,8: смешивают 4 части 0,25 н уксусной кислоты (проверить титрованием) и 6 частей 0,25 н ацетата натрия (содержит 34 г CH₃COONa * 3Н₂О в 1 л).

VI. Глюкозооксидаза — сухой препарат активностью 3000 ед/мг или больше.

VII. Пероксидаза из хрена. Желательно использовать кристаллический препарат фирмы «Реанал» (Венгрия): 1 мг растворяют в 5 мл ацетатного буфера, в холодильнике можно хранить несколько дней.

VIII. Рабочий реактив: в 80 мл ацетатного буфера растворяют 2 мг глюкозооксидазы и 1 мг пероксидазы, прибавляют 1 мл 1%-ного раствора ортотолуидина, перемешивают и доводят объем буферным раствором до 100 мл. Рабочий реактив должен быть прозрачным, бесцветным или иметь слабо-зеленый оттенок, в этом случае он устойчив при хранении на холоде. Если же окраска интенсивна или через несколько часов после приготовления начинает выпадать осадок, это значит, что ортотолидин недостаточно чистый и его надо перекристаллизовать.

IX. Калибровочные растворы глюкозы. Глюкозу предварительно высушивают при температуре 37 °С и хранят в эксикаторе. Сначала готовят основной раствор с концентрацией 50 ммоль/л, для чего 180 мг вещества растворяют в 20 мл насыщенного раствора (примерно 0,3%) бензойной кислоты. Из этого раствора готовят рабочие калибровочные растворы, содержащие 3; 6; 9; 12; 15; 18 и 21 ммоль/л, для чего берут 0,6; 1,2; 1,8; 2,4; 3; 3,6 и 4,2 мл основного раствора и доводят насыщенным раствором бензойной кислоты до объема 10 мл. Эти растворы содержат глюкозу в тех же концентрациях, в которых она бывает в крови, что облегчает расчеты при калибровке.

Далее по теме: