Способ I — Шелонга-Вендес использованием стабилизирующего свойства белка сыворотки крови.
Основной раствор билирубина: в колбе вместимостью 50 мл растворяют 40 мг билирубина в 30—35 мл 0,1 моль/л раствора карбоната натрия Na2CO3. Хорошо взбалтывают, не допуская образования пузырьков. Доводят до 50 мл 0,1 моль/л раствором Nа2СО3 и несколько раз перемешивают. Раствор стоек только в течение 10 мин от начала приготовления. В дальнейшем происходит окисление билирубина.
Рабочий раствор билирубина: к 13,9 мл свежей негемолизированной сыворотки здорового человека добавляют 2 мл свежеприготовленного основного раствора билирубина и 0,1 мл 4 моль/л раствора уксусной кислоты. Хорошо перемешивают. При этом выделяются пузырьки углекислого газа. Рабочий раствор стоек в течение нескольких дней. Этот раствор содержит точно на 100 мг/л, или 171 мкмоль/л, билирубина больше, чем сыворотка, взятая для приготовления раствора. Чтобы исключить при расчетах количество билирубина, содержащегося в этой сыворотке, при измерении на фотометре из величин экстинкции калибровочных проб вычитают величины экстинкции соответствующих разведений компенсационной жидкости.
Для приготовления компенсационной жидкости смешивают 13,9 мл той же сыворотки, которая использовалась для приготовления калибровочного раствора билирубина, 2 мл 0,1 моль/л раствора карбоната натрия и 0,1 мл 4 моль/л раствора уксусной кислоты. Для построения калибровочного графика готовят ряд разведений с различным содержанием билирубина.
К полученным разведениям прибавляют по 1,75 мл кофеинового реактива и по 0,25 мл диазосмеси. При появлении помутнения можно добавить по 3 капли 30%-ного раствора едкого натра. Измерение проводят при тех же условиях, что и в опытных пробах, через 20 мин.
Из компенсационной жидкости готовят разведения, аналогичные калибровочным (как указано ниже), и далее обрабатывают их так же, как калибровочные пробы.
Определение связанного билирубина
|
№ пробирки
|
Рабочий раствор билирубина мл
|
Изотонический раствор NaCl, мл
|
Количество билирубина в пробе
|
Концентрация билирубина в сыворотке крови, мкмоль/л
|
|
|
мг
|
мкмоль
|
||||
| 1 |
0,05
|
0,45
|
0,005
|
0,00855
|
17,1
|
| 2 |
0,1
|
0,4
|
0,01
|
0,0171
|
34,2
|
| 3 |
0,15
|
0,35
|
0,015
|
0,02565
|
51,3
|
| 4 |
0,2
|
0,3
|
0,02
|
0,0342
|
68,4
|
| 5 |
0,25
|
0,25
|
0,025
|
0,04275
|
85,5
|
Способ II — калибровочный график строится по готовому набору реактивов «Билирубин-эталон» («Лахема»).
Набор Био-Ла-Тест «Билирубин-эталон» включает:
-
билирубин лиофилизированный (точная концентрация билирубина приведена на этикетке флакона);
-
альбумин лиофилизированный.
Способ приготовления растворов билирубина указан в инструкции к набору.
Калибровочная кривая линейна до 170 мкмоль/л.