Принцип метода
Под воздействием НСl разрывается тетрапирроловая связь билирубина и образуются два дипиррола, которые диазотируются диазобензосульфоновой кислотой с образованием розово-фиолетового азобилирубина. Связанный билирубин реагирует быстро, несвязанный билирубин реагирует после добавления кофеинового реактива.
Необходимые реактивы
I. Кофеин.
II. Натрия бензоат.
III. Натрия ацетат 3-водный.
IV. Кофеиновый реактив: 5 г кофеина, 7,5 г бензоата натрия, 12,5 г ацетата натрия растворяют в 90 мл воды, нагревают до температуры 50—60 °С, хорошо перемешивают. После охлаждения доливают водой до 100 мл. Раствор стабилен в течение 2 недель.
V. Натрия хлорид, 154 ммоль/л (изотонический раствор): 0,9 г хлорида натрия помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доливают до метки водой.
VI. НСl концентрированная.
VII. Сульфаниловая кислота.
VIII. Диазосмесь.
Диазореактив I: 5 г сульфаниловой кислоты растворяют при нагревании в 300—400 мл воды, прибавляют 15 мл концентрированной НСl. Если сульфаниловая кислота полностью не растворяется, колбу помещают в теплую воду и помешивают. Только после растворения и охлаждения раствор доливают водой до 1 л. Реактив стабилен при хранении в посуде из темного стекла.
Диазореактив II: натрия нитрит, 5 г/л (0,07 моль/л): 0,5 г нитрита натрия помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доливают водой до метки. Реактив стабилен в течение 2—3 недель. при хранении в посуде из темного стекла. Перед работой смешивают 10 мл диазореактива I и 0,3 мл диазореактива II.
IX. Билирубин для построения калибровочного графика, 800 мг/л, или 1 368 мкмоль/л. Коммерческие препараты кристаллического билирубина содержат разные примеси, которые могут мешать реакции азосочетания. Рекомендуется использовать набор Био-Ла-Тест «Билирубин-эталон», содержащий билирубин высокой степени чистоты с коэффициентом молярной экстинкции не менее 6,05 * 104 л при 453 нм и растворении в хлороформе. Растворы билирубина нестойкие, поэтому их готовят с добавлением белка в качестве стабилизатора. Коммерческие препараты билирубина не связаны с глюкуроновой кислотой.
X. Натрия карбонат, 0,1 моль/л: 10,6 г безводного NаСО3 растворяют и доливают до 1 л водой.
XI. Уксусная кислота, 4 моль/л: 25 мл ледяной уксусной кислоты доливают до 100 мл водой.