Ферментативный (уреазный) метод определения мочевины (специальное оборудование, ход определения)

Специальное оборудование:

спектрофотометр или колориметр с кюветой для микроизмерений;
полуавтоматические микропипетки.

Ход определения

Перед определением сыворотку разводят 0,154 моль/л раствором хлорида натрия в отношении 1 : 9.

Опытная проба: 100 мкл рабочего раствора уреазы вносят в пробирку, добавляют 20 мкл разведенной сыворотки. Закрывают пробкой, перемешивают и инкубируют в течение 15 мин при температуре 37 °С. После инкубации добавляют 300 мкл цветного реактива и 300 мкл рабочего раствора гипохлорита натрия. Перемешивают и инкубируют в течение 20—30 мин при температуре 37 °С. Измеряют экстинкцию в кювете с толщиной слоя в 1 см при длине волны 500—560 нм (зеленый светофильтр) против холостой пробы. Окраска стабильна в течение нескольких часов.

Холостую пробу обрабатывают так же, как опытную, но вместо сыворотки берут 0,154 моль/л раствор NaCl.

Калибровочную пробу обрабатывают так же, как опытную, но вместо сыворотки берут калибровочный раствор мочевины. Измеряют при тех же условиях против холостой пробы.

Расчет количество мочевины в ммоль/л ведут по формуле: Е_оп / Ек*0,5*10,

где Е_оп — экстинкция опытной пробы;

Ек — экстинкция калибровочной пробы;

0,5 — концентрация мочевины в калибровочном растворе, ммоль/л;

10 — коэффициент разведения. Линейная зависимость между оптической плотностью и концентрацией мочевины сохраняется до 33 ммоль/л.

Примечание

Объемы сыворотки и реактивов можно пропорционально увеличивать.

Содержание мочевины сыворотки крови — 2,5—8,3 ммоль/л, мочевина суточной мочи — 333—583 ммоль/л.

Верхняя граница содержания мочевины в сыворотке крови зависит от приема белков с пищей. При приеме белков свыше 2,5 г/кг живой массы в сутки верхняя граница референтных величин содержания мочевины в сыворотке может быть повышена даже до 10 ммоль/л.

Далее по теме: