Ферментативный (уреазный) метод определения мочевины (принцип метода, необходимые реактивы)

Принцип метода

Мочевина под действием уреазы разлагается на углекислый газ и аммиак, который в щелочной среде с гипохлоритом натрия и фенолом образует индофенол синего цвета (метод Бертло). Светопоглощение образовавшегося продукта пропорционально содержанию мочевины в образце.

Необходимые реактивы

I. Уреаза. Для определения пригодна уреаза с активностью > 5 МЕ/мг.

II. Этилендиамин-N, N, N, N-тетрауксусной кислоты динатриевая соль (трилон Б).

III. ЭДТА-буфер, 0,0269 моль/л, рН 6,5 : 0,50 г трилона Б растворяют в 30—40 мл воды, доводят рН до 6,5 1 моль/л раствором едкого натра и доливают водой в мерной колбе до 50 мл.

IV. Основной раствор уреазы в буфере, 10 МЕ/мл: 20 мг уреазы (активность 5 МЕ/мг) растворяют в 10 мл буфера. Навеску уреазы берут в зависимости от активности фермента. Раствор стабилен в течение месяца при хранении в холодильнике.

V. Рабочий раствор уреазы. Перед началом определения берут необходимое количество основного раствора уреазы и разводят бидистиллированной водой в отношении 1 : 4.

VI. Фенол.

VII. Натрия нитропруссид 2-водный.

VIII. Цветной реактив: фенол — 0,11 моль/л, нитропруссид натрия — 0,18 моль/л: 0,0263 г нитропруссида натрия помещают в мерную колбу вместимостью 500 мл, приливают примерно 300 мл воды, растворяют при перемешивании. Затем добавляют 5,18 г фенола и доливают водой до метки. Реактив стабилен в течение месяца при хранении в холодильнике в посуде из темного стекла.

IX. Натр едкий, 1 моль/л, 0,26 моль/л.

X. Гипохлорит натрия.

Приготовление основного раствора гипохлорита: 100 г хлорной извести размешивают в течение 15 мин с 170 мл воды, после чего прибавляют при непрерывном помешивании раствор, состоящий из 170 мл воды и 70 г карбоната натрия. Масса сначала густеет, затем разжижается. Оставляют стоять до следующего дня. Надосадочную жидкость (гипохлорит натрия) сливают и фильтруют через промытый водой фильтр. Хранят в холодильнике в посуде из темного стекла.

Определение активности хлора: 1 мл основного раствора гипохлорита натрия смешивают с 100 мл воды. К 50 мл этого раствора добавляют 5 мл свежеприготовленного 50 г/л раствора йодида калия и 10 мл 6 моль/л раствора НСl. Титруют 0,1 н раствором тиосульфата натрия (готовят из фиксанала). Как только раствор приобретает слабо-желтую окраску, добавляют 10 капель 1%-ного раствора крахмала и титруют до обесцвечивания.

Концентрацию гипохлорита натрия рассчитывают по хлору: К = а*0,709,

где К — концентрация активного хлора, г/100 мл гипохлорита натрия;

а — количество тиосульфата, пошедшего на титрование, мл;

0,709 — коэффициент пересчета 1 мл тиосульфата натрия в концентрацию хлора, г/100 мл.

XI. Рабочий раствор гипохлорита натрия. После установления концентрации активного хлора основной раствор гипохлорита натрия разводят водой так, чтобы концентрация хлора составляла 0,78 г/л. Раствор гипохлорита с содержанием хлора 0,78 г/л смешивают с равным объемом 0,26 моль/л раствором едкого натра (100 мл + 100 мл). Активность хлора проверяют не реже одного раза в 2 недели. Рабочий раствор содержит 0,011 моль/л гипохлорита и 0,13 моль/л едкого натра. Раствор хранят в холодильнике в посуде из темного стекла.

XII. Мочевина.

XIII. Бензойная кислота, 2 г/л (кислоту растворяют при нагревании).

XIV. Калибровочный раствор мочевины, 0,5 ммоль/л: 15 мг мочевины растворяют в мерной колбе вместимостью 500 мл в 2 г/л растворе бензойной кислоты. Раствор стабилен при хранении в холодильнике.

XV. Натрия хлорид, 0,154 моль/л.

Далее по теме: