Определение белковых фракций сыворотки крови методом электрофореза (унифицированный метод проведения тимоловой пробы)

Тимоловая проба относится к коллоидно-осадочным, или флокуляционным, реакциям белков плазмы. Флокуляция (осаждение) белков обычно наступает при изменении их заряда, снижении количества воды в сольватной оболочке, при увеличении размеров коллоидных частиц.

Принцип метода

Тимоловая проба основана на помутнении смеси при взаимодействии сыворотки с насыщенным раствором тимола в вероналовом буфере. При взаимодействии тимоло-вероналового буфера с крупнодисперсными белками плазмы (β- и γ-глобулинами) помутнение образует глобулиново-тимол-липидный комплекс.

Необходимые реактивы:

тимол, 100 г/л спиртовой раствор: 10 г очищенного тимола растворяют в 96%-ном этиловом спирте в мерной колбе вместимостью 100 мл. Очистка тимола: 100 г тимола растворяют в 100 мл 96%-ного этилового спирта, фильтруют. К фильтрату прибавляют 1 л холодной воды, сильно встряхивают и оставляют стоять на 20 мин. Затем фильтруют; кристаллы, оставшиеся на фильтре, промывают 2 раза холодной водой, сушат до постоянной массы вначале на фильтровальной бумаге, затем в течение 2—3 дней в эксикаторе над безводным хлоридом кальция;
5,5-диэтилбарбитуровая кислота (веронал), фарм;
5,5-диэтилбарбитуровой кислоты натриевая соль (мединал), фарм;
буферный раствор: 2,76 г веронала и 2,06 г мединала растворяют и доводят водой до 1 л (хранят в холодильнике; при появлении осадка раствор не годен к употреблению);
тимолово-вероналовый буфер рН 7,55—7,6: в мерной колбе вместимостью 100 мл смешивают 80 мл буферного раствора и 1 мл 100 г/л спиртового раствора тимола, встряхивают и доливают буферным раствором до метки, проверяют рН;
бария хлорид;
калибровочный раствор:

раствор хлорида бария: 1,175 г хлорида бария растворяют и доводят до 100 мл водой;
серная кислота, 0,1 моль/л.

Суспензия сульфата бария: 3 мл раствора хлорида бария наливают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем до метки 0,1 моль/л раствором серной кислоты, при температуре 10 °С (при этой температуре размеры частиц преципитированного сульфата бария дают относительно стабильный результат). Суспензию сульфата бария готовят перед употреблением.

Ход определения

К 6 мл тимолово-вероналового буферного раствора прибавляют 0,1 мл сыворотки, оставляют стоять 30 мин и затем измеряют оптическую плотность при длине волны 630—690 нм (красный светофильтр) против тимолово-вероналового буфера в кюветах с толщиной слоя в 1 см. Реакцию проводят при комнатной температуре.

Расчет ведут по калибровочному графику.

Построение калибровочного графика: из калибровочного раствора сульфата бария (суспензии) готовят разведения, соответствующие единицам помутнения по Шенк-Хогланд. Калибровочные растворы хорошо встряхивают и тотчас при длине волны 630—690 нм в кюветах с толщиной слоя в 1 см против воды измеряют.

Примечание

Можно использовать готовый набор реактивов Био-Ла-Тест «Тимоловая проба» («Лахема»), в состав которого входят трис-буфер и малеиновая кислота.

Подобно всем флокуляционным тестам тимоловая проба является неспецифической реакцией. Однако она достаточно информативна для оценки функционального состояния печени. Проба положительна в 90—100% случаев при вирусном гепатите уже в преджелтушной стадии, при безжелтушной форме заболевания, а также при токсическом гепатите, постнекротическом циррозе печени, коллагенозах, малярии, вирусных инфекциях. При механической желтухе проба отрицательна.

Норма — 0,4 единицы.

Далее по теме: