Определение белковых фракций сыворотки крови методом электрофореза (электрофоретическое разделение на бумаге)

Необходимые реактивы:

буфер, можно использовать различные виды буферов — мединал-вероналовый, боратный, трис-буфер:

мединал-вероналовый буфер рН 8,6 : 10,3 г мединала и 1,84 г веронала растворяют и доводят до 1 л водой;
трис-буфер рН 8,9: трис-(оксиметил)-аминометан — 60,5 г, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) — 6 г, борная кислота — 4,6 г, вода — до 1 л.

раствор красителя, используют различные красители — бромфеноловый синий, амидо черный, азокармин Б и др.: 1 г бромфенолового синего и 20 г двухлористой ртути (сулемы) растворяют в воде, добавляют 40 г ледяной уксусной кислоты и доводят водой до 2 л (хранят в посуде из темного стекла);
раствор для элюирования — натр едкий, 0,03 моль/л.

Специальное оборудование:

прибор для электрофореза на бумаге;
хроматографическая фильтровальная бумага марки «Б» (качество фильтровальной бумаги имеет большое значение: она должна быть однородной и плотной).

Ход определения

Подготовка прибора: в камере необходимо поддерживать определенную влажность воздуха, чтобы предохранить фильтровальную бумагу от высыхания. Для этого прибор закрывают крышкой. Буферный раствор в разных отделах камеры должен иметь одинаковый уровень, чтобы избежать переливания жидкости через ленту.

Подготовка бумаги: полосы фильтровальной бумаги смачивают раствором свежего буфера. Избыток буфера удаляют, отжимая полосы между лентами фильтровальной бумаги, и помещают их в электрофоретическую камеру. Бумажная лента может быть расположена горизонтально (горизонтальный электрофорез) или под углом (вертикальный электрофорез). При горизонтальном электрофорезе бумажная лента должна быть хорошо натянута.

Нанесение сыворотки: на край ленты наносят по 5—10 мкл негемолизированной сыворотки в виде поперечной полосы, отступив на 0,5 см от краев.

Проведение электрофореза: камеру закрывают крышкой и проводят электрофорез сыворотки в течение 6—24 ч при напряжении от 3 до 8 В на 1 см пути тока. Продолжительность электрофореза устанавливают в зависимости от силы и напряжения тока, вида буферного раствора, рН, длины, ширины и толщины бумажных полос.

Обработка бумажных полос: выключают ток, вынимают ленты, сушат в сушильном шкафу в течение 10 мин при температуре 105 °С и красят, погружая в раствор красителя на 20 мин. Краситель сливают и ленты несколько раз промывают 20 г/л раствором уксусной кислоты до устранения фона (окрашенные участки бумаги, свободные от белка). Ленты вновь просушивают на воздухе.

Расчет: измерение проводят на денситометре или на фотометре после элюирования. Результаты выражают в процентах.

Элюирование: кусочки ленты, содержащие отдельные фракции, вырезают и помещают в пробирки для элюирования. Для этого в каждую пробирку с глобулиновой фракцией приливают по 10 мл 0,02 моль/л раствора NaOH, к альбуминовой фракции — 20 мл и оставляют в течение 1—2 ч. Измерение проводят в кювете с толщиной слоя 1 см против 0,02 моль/л раствора NaOH при 500—560 нм (зеленый светофильтр). Величину экстинкции альбуминов умножают на 2. Определяют сумму экстинкции всех фракций, принимая ее за 100%, и вычисляют долю каждой фракции.

Далее по теме: